PIP對細胞糖代謝AMPK信號通路GLUT4的干預研究

來源: www.411242.buzz 發布時間:2017-01-03 論文字數:35527字
論文編號: sb2017010114342316215 論文語言:中文 論文類型:碩士畢業論文
本論文是藥學論文,筆者研究主要目的是通過 3T3-L1 脂肪細胞 IR 模型和分化后的 C2C12 成肌細胞,證明了 PIP 對胰島素抵抗的改善效果是通過 AMPK 這條信號通路實現的,并通過分子生物學技術分析
引言
 
隨著世界經濟的迅速發展,伴隨著人民生活方式的改善以及飲食結構的變化,2 型糖尿?。═ype 2 DiabetesMellitus,T2MD)的發病率逐年都在上升,研究改善胰島素抵抗的藥物對于治療代謝綜合征相關的疾病具有重大的意義。蓽茇是胡椒科植物蓽茇的成熟或近成熟的干燥果穗,是藏、蒙、中醫習慣用藥,臨床用于治療消化不良、食欲不佳、腹部脹痛、泄瀉、嘔吐等癥狀[2]。胡椒堿(piperine,PIP)是蓽茇這種中藥的主要活性成分,屬桂皮酞胺類生物堿,廣泛存在與自然界中,特別是胡椒科植物大量存在,現代藥理學研究發現其具有抗氧化、調節脂代謝、免疫調節、抗癌癥、增強生物利用度、有助于藥物代謝等作用[3]。
本課題組近些年實驗研究已表明,蓽茇醇提取物的不同濃度能夠降低胰島素抵抗大鼠模型的空腹血糖水平、血清中游離脂肪酸、血壓、可改善糖耐量異常的情況,增強胰島素敏感指數等關鍵指標的病理性變化等。細胞方面,前脂肪細胞誘導分化成脂肪細胞已經相對成熟,對脂肪細胞中涉及腺苷酸活化蛋白激酶信號通路相關靶點做了初步研究,為深入開展蓽茇的有效成分胡椒堿對胰島素抵抗糖代謝關鍵靶點干預作用研究奠定基礎。
AMPK 信號通路是不同于胰島信號信號通路的,首先它參與葡萄糖代謝過程是通過將 GLUT4 向細胞膜轉移,其次是磷酸化 AMPK 信號通路來開啟 GLUT4 的基因表達。AMPK 在肌肉細胞中被激活時,能提高葡萄糖的攝取能力,同時伴隨葡萄糖轉運蛋白 4 的位移。而脂肪細胞中,AMPK 的激活同樣能增強葡萄糖的轉運,并使葡萄糖轉運體 4 從細胞內轉移至膜上,從而增加葡萄糖的攝取能力,并調節細胞因子 GLUT4 表達水平,可作為其對糖代謝調節的重要依據。
本課題研究主要目的是通過 3T3-L1 脂肪細胞 IR 模型和分化后的 C2C12 成肌細胞,證明了 PIP 對胰島素抵抗的改善效果是通過 AMPK 這條信號通路實現的,并通過分子生物學技術分析 PIP 對脂肪細胞和肌肉細胞中 AMPKα 和 GLUT4的干預作用,來探索可能作用機制。
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第一章 3T3-L1前脂肪細胞的培養和脂肪細胞IR模型的建立
 
1 實驗材料
1.1 細胞株
3T3-L1 前脂肪細胞株,購于中國科學院昆明動物所,細胞資源中心。
1.2 主要儀器
CO2培養箱(SW-CJ-1F 型):日本三洋科技有限公司
超凈工作臺(SW-CJ-1F 型):蘇州安泰空氣技術有限公司
倒置熒光顯微鏡(ECLIPSE TS100):日本 Nikon 公司
臺式離心機(allegraX-22):美國貝克曼公司
蠕動泵驅動器(WT600-1F):保定蘭革恒流泵有限公司
漩渦混合器(QL-861 型):江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司
十萬分之一電子分析天平(AB265-S):梅特勒-托利多公司
酶標分析儀(Infinitem200 PRO):瑞士 Tecan 公司
Milli-Q 超純水機:美國 Millipore 公司
RO 純水機:美國 Biogen 公司
搖床(TS-8 型):江蘇其林貝爾儀器公司
恒溫水浴鍋:北京永光明醫療器械廠
1.3 主要試劑
高糖培養基(DMEM):Hyclone 公司
中美胎牛血清(FBS):BI 公司
青霉素-鏈霉素溶液:Hyclone 公司
胰蛋白酶:Hyclone 公司
乙二胺四乙酸(EDTA):西安沃爾森公司
磷酸鹽緩沖液干粉(PBS):Solarbio 公司
牛胰島素:美國 Sigma 公司
地塞米松(DEX):美國 Sigma 公司
3-異丁基-1 甲基-黃嘌呤(IBMX):美國 Sigma 公司
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2 實驗方法
2.1 3T3-L1 前脂肪細胞的培養
2.1.1 細胞復蘇
將 3T3-L1 前脂肪細胞從-196℃液氮中取出,立即放入 37℃水浴鍋中進行水浴,水浴時緩緩搖動凍存管使其溶解均勻,解凍 2min 后,細胞凍存液溶解完全,迅速將細胞拿進超凈工作臺中,用槍頭將凍存管中的含細胞凍存液吸出,緩緩滴入已準備好細胞培養液的培養瓶中,標記好細胞復蘇日期,細胞代數,放入 CO2培養箱中,待 4 小時后,細胞大多數貼壁時,進行換液,繼續培養。
2.1.2 細胞傳代培養
當細胞在培養瓶中長至 80%-90%左右時即可進行傳代,倒去培養瓶中培養液,延瓶壁加入 2mlPBS 緩沖液充分搖勻,然后倒去,加入含有 EDTA 的胰酶消化液 1ml,使其均勻覆蓋瓶底,放入 CO2培養箱 3min 進行消化,待消化完成后加入完全培養基終止消化,并吹打均勻,將瓶中液體倒入離心管中進行離心。離心完后加入適量培養液進行吹打,通過顯微鏡觀察細胞密度,來決定傳代密度,分瓶完成后,在培養瓶上標明代數及傳代日期后,放入 CO2培養箱繼續培養
2.1.3 細胞凍存
觀察細胞生長條件和狀態選用對數生長期的細胞進行細胞凍存,從 CO2恒溫培養箱取出正在培養的細胞,倒去培養瓶中培養液,加入 2ml PBS 緩沖液小心沖洗瓶底,然后棄掉緩沖液,加入 1ml 含 EDTA 的胰蛋白酶細胞消化液,讓其均勻覆蓋培養瓶底,待 3min 后,80%左右細胞消化下來時,加入含有胎牛血清的完全培養基使其終止消化,并用移液器吹打懸液,并將液體倒入離心管中,進行細胞離心。離心完成,加入剛剛配置好后放入 4℃冰箱的含有 10%DMSO 的胎牛血清,并吹打混勻細胞,根據細胞密度決定凍存多少支。在凍存管上注明凍存細胞的種類,日期以及細胞傳代數,放入程序降溫盒中過夜,第二天轉移至-196℃液氮中進行長期保存。

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第三章 PIP 對 3T3-L1 脂肪細胞 AMPKα,GLUT4 mRNA 和蛋白的影響.......26
1 實驗材料.....................................................26
2 實驗方法.....................................................27
第四章 PIP 對 C2C12 肌肉細胞糖代謝的改善作用...................41
1 實驗材料.....................................................41
2 實驗方法.....................................................41
第五章 PIP 對 C2C12 肌肉細胞 AMPKα,GLUT4 mRNA 和蛋白影響......48
1 實驗材料..................................................48
2 實驗方法....................................................48
 
討論
 
1 研究背景
眾所周知,脂肪和肌肉組織是胰島素的關鍵靶組織,對糖代謝相關領域的研究具有重要意義。胰島素抵抗已成為許多代謝類疾病的病理生理基礎,以及發病機制的重要環節,為此它受到廣泛的關注。AMPK 被看做是一種參與調節多種細胞代謝的蛋白激酶,被稱為“能量感受器”[6],一旦其因為某種應激反應導致AMPK 被激活,它便可以增強葡萄糖的攝取和利用,并產生更多能量,抑制糖原的合成和糖異生以減少能量的消耗,從而使細胞達到一種穩態[7]。AMPK 調節包括肝臟,脂肪,肌肉在內的外周組織的糖代謝過程,本課題選取了典型的脂肪細胞和肌肉細胞進行體外培養,通過建立有效的脂肪細胞模型和成肌細胞來探討PIP 對于治療糖代謝紊亂引起的胰島素抵抗所產生的內在分子機制。課題組近幾年的實驗研究顯示,在動物實驗中,蓽茇提取物對于改善胰島素抵抗大鼠模型的葡萄糖水平,膽固醇水平,甘油三酯水平等具有顯著效果,在細胞實驗中,胡椒堿已被證實對于脂肪細胞 IR 模型,具有降低甘油三酯以及提高葡萄糖消耗量的功效。本研究在前期細胞實驗研究的基礎上,細化給藥濃度和時間點,探索胡椒堿的最佳量效和實效關系,在分子水平上,深入探索 PIP 對 AMPK 信號通路及相關靶點的干預作用,揭示其改善糖代謝紊亂的內在分子機制。
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2 細胞的選擇及與 AMPK 信號通路關系
脂肪組織作為胰島素的重要靶組織之一,是機體能量調節的重要器官[8],脂肪組織在胰島素抵抗引起的 2 型糖尿病中起著重要作用,3T3-L1 來源于小鼠胚胎成纖維細胞,在體外實驗中被廣泛應用于脂肪細胞功能的研究[9]。本實驗利用3T3-L1 前脂肪細胞誘導分化為成熟脂肪細胞后,經過地塞米松作用于細胞,建立脂肪細胞 IR 模型。胰島素抵抗作為 2 型糖尿病主要特征之一,是導致糖代謝紊亂的關鍵原因,有相關實驗研究表明[10],脂代謝紊亂的時間要先于糖代謝紊亂,將前脂肪細胞誘導分化為成熟脂肪細胞出現脂滴也是造成細胞內脂代謝紊亂的一種表現,本課題前期細胞實驗顯示,分化后的脂肪細胞內甘油三酯的含量明顯高于正常的前脂肪細胞,糖脂代謝的紊亂與胰島素抵抗關系密切,因此選用該細胞作為研究對象來探索代謝綜合征相關疾病可能存在的機制和機理。
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結論與展望
 
1 結論
在 3T3-L1 脂肪細胞中,PIP 與陽性藥羅格列酮一樣,通過增加 P-AMPKα蛋白表達來激活 AMPK 信號通路,并調節其下游 GLUT4 的表達水平,達到改善胰島素抵抗的作用,從而調節糖代謝紊亂。量效關系顯示,在 3T3-L1 脂肪細胞中 PIP 10μM 給藥濃度為最佳濃度。時效關系表明,AMPKα 在 24h 的藥物干預下,表達水平達到峰值。GLUT4 在 12h 時,表達水平最高,并且隨著時間的增加,其表達效果呈現出遞減趨勢。
在 C2C12 肌肉細胞中,PIP 與 ROG 一樣,通過增加 P-AMPKα 蛋白表達來激活AMPK信號通路,并且在PIP 10μM濃度干預下AMPKα和GLUT4的mRNA和蛋白表達水平達到峰值,說明該濃度的 PIP 對于 C2C12 肌肉細胞的干預作用最佳,同樣通過磷酸化 AMPKα 蛋白來激活該信號通路,來增加 GLUT4 的表達,達到改善糖代謝紊亂的效果。
總之,在 C2C12 肌肉細胞和 3T3-L1 脂肪細胞中,通過 PIP 干預作用下,能夠對 AMPK 信號通路以及下游靶點 GLUT4 進行調節,達到改善細胞糖代謝紊亂的效果。
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參考文獻(略)

原文地址:http://www.411242.buzz/yaoxuelw/16215.html,如有轉載請標明出處,謝謝。

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