茉莉酸甲酯對甘草次生代謝的調控

來源: www.411242.buzz 發布時間:2017-04-24 論文字數:38526字
論文編號: sb2017042214513016461 論文語言:中文 論文類型:碩士畢業論文
本論文是藥學論文,筆者開展 MeJA 對甘草有效成分甘草酸和甘草苷積累及相關基因表達調控的研究,試圖在分子水平闡述 MeJA 對甘草根次生代謝的調控及其機制。
第一章 序論
 
1.1 甘草資源現狀
目前野生資源采挖破壞嚴重,數量大幅度下降,在 1980~1990 年所收購的甘草中,甲級甘草占 30 %以上,而截至 2003 年只占 5 %[12]。我國從最初鼓勵甘草出口轉變為控制甘草出口再到現在進口甘草。甘草資源危機已經威脅到中國中藥產業和西北地區的生態安全。以我國最大的甘草產區之一新疆為例,1988年甘草分布面積約80萬hm2,儲量約 100 t。2001 年自治區對甘草資源調查統計,甘草資源面積僅為 61 萬 hm2,儲量約 50~60 萬 t。根據黃明進 2010 年調查[13]發現根據各省區蘊藏量統計結果,粗略估算全國野生甘草蘊藏量不到 50 萬 t,人為采挖已嚴重影響了野生甘草的種群密度。在野生資源量銳減的同時伴隨的是生態環境惡化,在寧夏鹽池縣甘草產區,各類沙丘和浮沙面積已從 1961 年的 18.3 萬 hm2上升到現在的 25.33 萬 hm2,短短幾十年增加了34.52 %,不但沙漠化加劇,草牧場退化也很嚴重。使野生特色資源植物甘草如同麻黃、發菜等遭到掠奪式采挖,直接造成道地中藥材資源量的銳減、地表植被的大面積破壞和土地沙漠化的急劇擴展[14]。甘草是多年生草本植物,生長周期長,更新較慢,一旦受到破壞短時間內難以恢復。如今,甘草遭過量采挖的同時已經嚴重影響到內蒙古、新疆和甘肅等甘草主要產區的生態環境。
人工栽培是解決甘草問題的最有用的辦法,一方面可以緩解野生甘草的需求,另一方面可以給予野生甘草地區充足的時間恢復,近年來人工栽培資源成為藥材的主要商品來源。但是栽培甘草仍然無法滿足市場需求,其中一個原因是由于國人傳統觀念對于野生中藥材的偏好,認為野生的甘草要好于人工栽培。另外一個重要原因是產量和質量問題,目前我國栽培甘草藥材地里蓄積量估計在 25 萬 t[13],大部分人工甘草的有效成分含量與野生甘草相比存在很大的差距,不同地區人工甘草的產量和質量也存在明顯差異。人工栽培甘草通常采用育苗 1 年,再移栽種植 1~2 年的生產方式,因此其產量和品質與種苗的質量、植株的生長發育有著復雜而密切的關系[15]。研究發現,一至四年生人工栽培甘草的甘草酸質量分數沒有顯著差異,平均在 1. 5 %以下,五年生以后質量分數快速升高,甚至平均達到 2 %以上,但再高生長年限也未達到野生甘草平均 4. 43 % 的水平[16]。延長栽培年限對提高人工甘草藥材質量有一定的作用,但若在經濟效益角度來看,成本提高了從而效益降低了。因此在適當栽培周期開展栽培甘草的人工干預以提高甘草藥材質量,是當前人工甘草栽培技術研究的重點與熱點。
......
 
1.2 提高栽培藥用植物品質的途徑
目前關于環境脅迫促進藥用植物次生代謝產物積累的研究成果有很多,有研究發現干旱條件對其他植物如喜樹的喜樹堿含量明顯升高[19],Tang 等發現,萬壽菊在水分脅迫條件下,酚類物質的含量明顯高于其在水分充足時[20]。周應群等研究發現隨著土壤相對含水量的遞減,甘草生物量分配較多地流向根部,使根冠比明顯增大[21]。廖建雄等研究表明,適當的干旱脅迫有利于提高甘草中的甘草酸含量[22];劉長利等也發現干旱脅迫有利于甘草苷的合成積累[23];劉艷等研究發現,適度干旱使茉莉酸(JA)大量積累,JA 進而誘導下游次生代謝途徑活化,次生代謝產物積累,又有利于甘草有效成分的積累[24]。杜茜研究表明栽培甘草如果主要以收獲藥材為目的,只有控制土壤水分在 12 %以下,才能保證甘草藥材的品質[25]。唐曉敏等研究鹽分脅迫對甘草藥材質量的影響,發現鹽脅迫植株除多糖外,甘草酸、甘草苷、總黃酮、總皂苷含量均高于對照組。鹽脅迫下甘草酸和甘草苷含量與可溶性糖、淀粉、β-香樹脂醇含量表現為負相關關系[26]。還有很多研究表明植物受到生物脅迫時,其次生代謝產物積累有明顯的變化。苜蓿葉感染莖點酶后芒柄花素苷和苜蓿素的積累增加[27],魏明等研究表明真菌能促進石斛生長和有效成分的積累[28],丁小麗研究發現一些內生真菌與丹酚酸B、咖啡酸等幾種有效成分的含量極顯著相關[29]。左應梅等用枯草芽孢桿菌、哈茨木霉、德根貝等微生物菌劑處理三七植株,發現德根貝在一定濃度對三七生長發育、產量及質量等方面均有顯著促進作用[30]。適當的生物脅迫不僅可以促進藥用植物的生長,而且還可增強含有宿主的植物抗病蟲侵害以及對逆境的適應能力。
......
 
第二章 MeJA 對甘草有效成分積累的調控
 
在植物遇到生物或非生物脅迫時,茉莉酸(酯)類物質就會作為內源信號分子參與其抗逆反應。當植物在生長發育過程中遭受細菌、真菌、病毒和害蟲等生物脅迫時,其體內就會分別發生 SA、JA 和乙烯等內源激素調控的應答反應[71]。當植物受到以干旱脅迫為主的非生物脅迫時,內源 JA 含量的增加是快速、瞬時的,隨著脅迫時間的延長逐漸降低到基礎水平。JA 通過調節植物氣孔,調控干旱脅迫的關鍵基因表達,從而提高植物抗旱性和促進次生代謝產物合成與積累,并且部分植物次生代謝產物能作為調節物質進一步提高植物抗逆性[72]。外源應用 MeJA 能夠產生與生物和非生物脅迫相似的效果,激發防御植物基因的表達,誘導植物的次生代謝產物合成和積累,這可應用于提人工高甘草次生代謝產物。王學勇與李明等研究均外施 MeJA 誘導丹參,分別發現丹參毛狀根和葉片的次生代謝產物含量提高[73、74]。本章實驗通過施加 MeJA,測定甘草有效成分含量的變化,考察其對甘草次生代謝產物積累的調控。
2.1 材料與儀器
2.1.1 植物材料
本章節使用試劑及儀器分別見表 2-1 和表 2-2。

......
 
2.2 方法
2.2.1 甘草的栽培
試驗在廣東藥科大學大學城校區藥圃內進行,挑選綠色飽滿的甘草種子并置于自來水中浸泡過夜,于 2014 年 3 月播種于培養基質為營養土:沙土:本地土=2:2:1 的花盆中。待甘草苗長至 5 cm 后移栽于同樣培養基質的花盆中,每個花盆移栽兩株甘草,并置于陽光充足透風的地方栽培,定期澆水并進行殺蟲滅菌,栽培 6 個月作為試驗材料。
2.2.2 MeJA 溶液處理
以乙醇為助溶劑,配制 20、50、100 μmol/L 3 個濃度的 MeJA 溶液。6 月齡的甘草苗作為試驗材料,分別噴施濃度為 0、20、50、100 μmol/LMeJA 溶液至溶液布滿葉面滴下為止,每 3 天噴施一次,連續處理 3 次,每個樣品重復 3 次,第 9 d 采收樣品根及根莖,曬干用于甘草有效成分含量測定。
2.2.3 含量測定
取 2.2.3.2 制備的對照品母液進行梯度稀釋制備成系列標準溶液,取 10 μL 對照品溶液注入液相色譜儀按 2.2.2.1 的色譜條件進行含量測定。在甘草苷、甘草酸銨保留時間處記錄對應的峰面積作為標準曲線的縱坐標(y),并以對照品濃度為橫坐標(x)繪制標準曲線。根據得到的標準曲線(見圖 2-1)計算回歸方程和相關系數,其中甘草苷:y=16808 x﹣3265.8,R2=0.9998(n=6);甘草酸銨:y=5261.9 x﹣1132,R2=0.9998 (n=6)。結果表明,甘草苷、甘草酸銨濃度在 5.234~65 μg/ mL 范圍內線性關系良好。
取已知濃度的樣品按 2.2.3.3 供試品溶液的制備方法同時制備 6 份供試品溶液,并向供試品溶液中加入等濃度等體積的甘草苷、甘草酸銨對照品溶液,混勻后按 2.2.2.1的色譜條件測定。根據加樣回收率公式計算加樣回收率和 RSD 值:加樣回收率(%)=(C-A)/B×100 %,其中 A:樣品中所含被測成分含量;B:加入對照品的量;C:加入對照品后所測的的總量。計算得到的甘草苷、甘草酸加樣回收率在 95 %~ 101 %之間,證明本方法制備的供試品溶液效果良好。
......
 
第三章 MeJA 對甘草有效成分生物合成相關基因表達的調控.......................16
3.1 材料與儀器.........................................................16
3.1.1 植物材料.....................................................16
第四章 GubAS 全長 cDNA 克隆與表達載體的構建......................25
4.1 材料與儀器.................................................25
4.1.1 植物材料...................................................25
第五章 總結與展望..................................................43
 
第四章 GubAS 全長 cDNA 克隆與表達載體的構建
 
甘草酸作為甘草的有效成分之一,屬于三萜類化合物。其生物合成主要為甲羥戊酸途徑,前期階段由法呢基焦磷酸聚合生成鯊烯,進一步氧化成 2,3-氧化鯊烯后經 β-香樹脂醇合酶(β-AS)催化生成 β-香樹脂醇,最后在細胞色素 P450 家族成員的催化作用下生成甘草次酸和甘草酸[91](圖 4-1)。其中,2, 3-氧化鯊烯環化是產生三萜皂苷的重要步驟,由 OSCs 基因家族所催化[92]。β-AS 是 OSCs 家族的一員,是合成 β-香樹脂及其下游產物甘草次酸的相關酶,也是產生三萜產物多樣性的原因之一,在甘草酸合成途徑中起著重要作用。
結合第二章和第三章中 MeJA 對甘草酸及其生物合成途徑相關酶 GubAS 基因的調控結果可以得知,中低濃度MeJA溶液誘導甘草一定時間能提高GubAS的表達水平,促進甘草酸的合成和積累。因此本章實驗在課題組前期研究獲得的轉錄組數據(Unigene0081362)中 GubAS序列基礎上進行克隆,構建 GubAS 陽性重組表達質粒。后續實驗中將利用含有pBI-GubAS 的發根農桿菌進行轉基因毛狀根誘導,和培育轉 GubAS 基因植物,研究GubAS 基因功能,為培養甘草優良品質以及利用生物工程技術生產甘草有效成分等奠定基礎。
 
4.1 材料與儀器
4.1.1 植物材料
見第二章 2.1.1。
4.1.2 儀器
除表 4-1,其余儀器同第二章 3.1.4。
......
 
第五章 總結與展望
 
本研究以 6 月齡甘草為材料,利用不同濃度 MeJA 對甘草處理不同時間,通過考察誘導后甘草的有效成分含量及其生物合成途徑相關酶基因表達量變化,探討 MeJA對甘草次生代謝的調控作用及機制。發現 20、50 μmol/LMeJA 顯著促進甘草酸的合成和積累;同時發現 20 μmol/LMeJA 處理甘草 0~6 h、50 μmol/LMeJA 處理甘草 0~2 h 提高 GubAS 的表達量,20 μmol/LMeJA 處理甘草 2~6 h、50 μmol/LMeJA 處理甘草 0~2 h也提高 GubAO 的表達量,隨著處理時間延長促進作用逐漸減弱;但是 100 μmol/LMeJA的處理對甘草酸含量和 GubAS、GubAO 表達影響也不顯著。對于甘草苷而言,20 μmol/LMeJA 對甘草苷的合成和積累作用不明顯,但是隨著處理濃度提高出現含量降低的現象。GuDOCS 的表達在 20 μmol/LMeJA 處理 0~6 h 的甘草中有顯著提高,隨著處理時間延長逐漸恢復至對照組水平;50 、100 μmol/LMeJA 處理對 GuDOCS 的作用不顯著,而且隨著處理時間延長出現抑制 GuDOCS 表達的現象。因此推斷 GubAS 和 GubAO 作為甘草酸生物合成途徑下游重要酶基因,中低濃度的 MeJA 對甘草進行短時間處理能促進甘草酸生物合成途徑下游酶基因表達,也即通過促進甘草酸生物合成,從而促進甘草酸的合成和積累。而低濃度 MeJA 短時間處理雖然促進 GuDOCS 的表達,但是未體現在促進甘草苷的合成和積累;并且隨著 MeJA 濃度提高和處理時間延長,抑制了GuDOCS 表達,影響甘草苷的合成積累進而導致甘草苷含量的降低。
基于 MeJA 誘導甘草中有效成分含量及其生物合成途徑重要酶表達量的變化,以及 GubAS 在甘草三萜化合物合成途徑中的重要作用。選擇 GubAS 進行一系列克隆和表達載體構建實驗,成功獲得重組質粒 pBI-GubAS。pBI-GubAS 屬于植物表達質粒,為后續獲得轉基因植株或轉基因毛狀根研究該基因功能和培養甘草優良品種,通過生物工程技術生產藥用植物的活性成分,人工手段調控植物次生代謝產物的生產提供依據。
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參考文獻(略)

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